食品安全檢測(cè)儀中免疫層析技術(shù)的核心原理是抗原-抗體特異性結(jié)合+層析分離可視化，通過試紙條快速實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物（如農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、致病菌）的定性/半定量檢測(cè)；假陽性控制則需從抗體特異性、反應(yīng)體系、操作流程等多環(huán)節(jié)優(yōu)化，具體原理與控制方案如下：

一、免疫層析技術(shù)原理（以膠體金標(biāo)記為例）

免疫層析技術(shù)基于“免疫反應(yīng)特異性”與“層析流動(dòng)分離”的結(jié)合，典型試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水墊四部分組成，核心步驟分為 3 個(gè)階段：

1. 樣品預(yù)處理與層析啟動(dòng)

待檢測(cè)樣品（如蔬菜汁、牛奶、血清）經(jīng)簡(jiǎn)單預(yù)處理（如離心去雜質(zhì)、緩沖液稀釋）后，滴加至試紙條的樣品墊；

樣品在毛細(xì)作用下，沿試紙條向吸水墊方向流動(dòng)，途中先經(jīng)過結(jié)合墊—— 結(jié)合墊預(yù)先吸附了“膠體金標(biāo)記的特異性抗體”（金標(biāo)抗體，如抗克倫特羅單克隆抗體），樣品中的目標(biāo)抗原（如克倫特羅）會(huì)與金標(biāo)抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成“抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物”。

2. 特異性結(jié)合與信號(hào)顯示

復(fù)合物隨樣品繼續(xù)流動(dòng)至硝酸纖維素膜（NC膜） ，NC膜上預(yù)先固定了兩條關(guān)鍵線條：

檢測(cè)線（T線）：包被有“針對(duì)目標(biāo)抗原另一表位的捕獲抗體”（如抗克倫特羅多克隆抗體），可與“抗原-金標(biāo)抗體復(fù)合物”再次結(jié)合，使復(fù)合物在T線處富集 —— 因膠體金呈紅色，T 線會(huì)顯現(xiàn)紅色條帶，條帶顏色深淺與樣品中抗原濃度正相關(guān)（濃度越高，顏色越深，半定量依據(jù)）；

質(zhì)控線（C線）：包被有“針對(duì)金標(biāo)抗體的二抗”（如抗鼠IgG抗體），無論樣品中是否有目標(biāo)抗原，金標(biāo)抗體都會(huì)與C線的二抗結(jié)合并顯色 ——C線顯色證明層析過程正常、試劑有效，若C線不顯色，檢測(cè)結(jié)果無效。

3. 結(jié)果判讀（定性檢測(cè)為例）

陽性結(jié)果：C線顯色，T 線不顯色（樣品中抗原濃度過高，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金標(biāo)抗體，導(dǎo)致 T 線無復(fù)合物富集）；或 T 線顯色（濃度較低時(shí)，部分復(fù)合物結(jié)合 T 線），顏色深淺可通過檢測(cè)儀對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)半定量（如“+”“++”對(duì)應(yīng)不同濃度范圍）；

陰性結(jié)果：C線顯色，T線清晰顯色（樣品中無目標(biāo)抗原，金標(biāo)抗體未結(jié)合抗原，直接與 T 線捕獲抗體結(jié)合顯色）；

無效結(jié)果：C線不顯色（無論 T 線是否顯色），說明層析失敗或試劑失效，需重新檢測(cè)。

二、假陽性產(chǎn)生原因（核心誘因）

假陽性指“樣品中無目標(biāo)抗原，卻檢測(cè)出陽性結(jié)果”，本質(zhì)是“非特異性結(jié)合導(dǎo)致 T 線誤顯色”，主要誘因包括3類：

1. 抗體特異性不足（核心原因）

金標(biāo)抗體或T線捕獲抗體，與樣品中的“非目標(biāo)物質(zhì)”（如結(jié)構(gòu)類似物、雜蛋白）發(fā)生交叉反應(yīng) —— 例如，檢測(cè)瘦肉精時(shí)，抗克倫特羅抗體可能與沙丁胺醇（結(jié)構(gòu)類似的β2受體激動(dòng)劑）結(jié)合；檢測(cè)沙門氏菌時(shí)，抗沙門氏菌抗體可能與大腸桿菌的表面抗原交叉反應(yīng)，導(dǎo)致T線誤顯色。

2. 反應(yīng)體系干擾

樣品基質(zhì)干擾：樣品中的油脂、色素、多糖等雜質(zhì)，可能吸附在金標(biāo)抗體表面，改變抗體構(gòu)象，使其非特異性結(jié)合T線捕獲抗體；或雜質(zhì)在T線處非特異性沉積，掩蓋背景，誤判為顯色；

緩沖液條件不當(dāng)：pH值（如pH過高導(dǎo)致抗體變性）、離子強(qiáng)度（如高鹽環(huán)境促進(jìn)非特異性吸附）、封閉劑缺失（NC膜未用BSA封閉，殘留疏水基團(tuán)吸附金標(biāo)抗體），均可能引發(fā)非特異性結(jié)合。

3. 操作與環(huán)境誤差

樣品處理不當(dāng)：如樣品稀釋倍數(shù)不足（雜質(zhì)濃度過高）、預(yù)處理時(shí)引入交叉污染（如容器殘留目標(biāo)抗原）；

檢測(cè)條件失控：溫濕度異常（如溫度＞30℃加速非特異性反應(yīng)，濕度＞80%導(dǎo)致NC膜吸潮，抗體擴(kuò)散）；檢測(cè)時(shí)間過長(zhǎng)（超過規(guī)定判讀時(shí)間，非特異性結(jié)合物持續(xù)富集T線）。

三、假陽性控制關(guān)鍵技術(shù)與方案

針對(duì)上述誘因，需從“試劑研發(fā)-樣品處理-操作規(guī)范”全流程制定控制策略，核心措施分為4類：

1. 提升抗體特異性（源頭控制）

抗體篩選與制備優(yōu)化：

采用“單克隆抗體+多克隆抗體組合”：?jiǎn)慰寺】贵w制備時(shí)，通過“細(xì)胞融合篩選高特異性雜交瘤細(xì)胞”（如僅與克倫特羅結(jié)合，不與沙丁胺醇交叉反應(yīng)）；T線用多克隆抗體，確保覆蓋抗原多表位，同時(shí)避免與類似物結(jié)合；

抗體純化：通過Protein A/G親和層析純化抗體，去除雜蛋白與低效價(jià)抗體，降低非特異性結(jié)合率（純化后抗體交叉反應(yīng)率需＜1%）。

抗體標(biāo)記工藝優(yōu)化：

膠體金標(biāo)記抗體時(shí)，控制“金標(biāo)比”（膠體金與抗體的質(zhì)量比，通常 10:1-20:1），避免抗體過量導(dǎo)致未結(jié)合的游離抗體殘留 —— 游離抗體可能直接結(jié)合 T 線捕獲抗體，引發(fā)假陽性；標(biāo)記后通過離心去除游離抗體，確保金標(biāo)抗體純度＞95%。

2. 優(yōu)化反應(yīng)體系與試紙條設(shè)計(jì)

緩沖液配方調(diào)整：

樣品稀釋液中添加“特異性封閉劑”：如BSA（牛血清白蛋白，0.5%-1%）封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，Tween-20（0.05%-0.1%）減少疏水吸附，EDTA（1-5mmol/L）螯合金屬離子（避免離子促進(jìn)抗體聚集）；

控制pH值與離子強(qiáng)度：根據(jù)抗體適宜的反應(yīng)條件調(diào)整（如單克隆抗體合適pH7.2-7.4，用Tris-HCl緩沖液維持；離子強(qiáng)度0.01-0.05mol/L，避免高鹽）。

NC膜與結(jié)合墊處理：

NC膜選擇高孔徑均勻性的型號(hào)（如8μm孔徑），并預(yù)先用“封閉液（含BSA、蔗糖）”浸泡處理，封閉膜上的疏水基團(tuán)與殘留活性位點(diǎn)；

結(jié)合墊添加“穩(wěn)定劑（如蔗糖、海藻糖）”，保護(hù)金標(biāo)抗體溫穩(wěn)定性，避免運(yùn)輸/儲(chǔ)存中變性導(dǎo)致非特異性結(jié)合。

3. 規(guī)范樣品處理與操作流程

樣品預(yù)處理標(biāo)準(zhǔn)化：

針對(duì)不同基質(zhì)制定專屬預(yù)處理方案：如檢測(cè)高脂樣品（牛奶、肉類）時(shí)，先用正己烷脫脂；檢測(cè)高色素樣品（果汁、醬油）時(shí)，用活性炭脫色，減少基質(zhì)干擾；

嚴(yán)格控制稀釋倍數(shù)：根據(jù)檢測(cè)限（如0.1μg/kg）確定極低稀釋倍數(shù)（如 10 倍稀釋），避免稀釋不足導(dǎo)致雜質(zhì)濃度過高。

操作與判讀規(guī)范化：

環(huán)境控制：檢測(cè)溫度控制在20-25℃，濕度40%-60%，避免陽光直射（防止抗體變性）；

時(shí)間控制：嚴(yán)格按說明書規(guī)定的“加樣后判讀時(shí)間”（如5-10分鐘）讀取結(jié)果，超時(shí)（如＞15分鐘）可能因非特異性吸附導(dǎo)致T線假陽性顯色。

4. 引入質(zhì)控與驗(yàn)證體系

陽性對(duì)照與陰性對(duì)照同步檢測(cè)：

每次檢測(cè)時(shí)，同步設(shè)置“陽性對(duì)照（已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品）”與“陰性對(duì)照（不含目標(biāo)抗原的空白樣品）”—— 若陰性對(duì)照出現(xiàn)假陽性，說明試劑或操作存在問題，需排查原因（如抗體交叉反應(yīng)、樣品污染）；

特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：

試劑研發(fā)階段，需用“結(jié)構(gòu)類似物、常見雜蛋白、干擾菌”進(jìn)行特異性驗(yàn)證 —— 如檢測(cè)氯霉素時(shí)，驗(yàn)證氟苯尼考、甲砜霉素等類似物是否引發(fā)交叉反應(yīng)，要求交叉反應(yīng)率＜0.1%，確?？贵w僅識(shí)別目標(biāo)物質(zhì)。

免疫層析技術(shù)通過“抗原-抗體雙特異性結(jié)合+層析分離”實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，核心是利用抗體特異性保證結(jié)果準(zhǔn)確；假陽性控制需從“源頭（抗體篩選）-過程（反應(yīng)體系優(yōu)化）- 終端（操作規(guī)范）”全鏈條管控，尤其需提升抗體特異性、減少基質(zhì)干擾、規(guī)范操作流程，才能確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性，滿足食品安全快速篩查的需求。

本文來源于深圳市芬析儀器制造有限公司http://www.ntbol.com/